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菌種凍干是微生物保存領(lǐng)域中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)

點(diǎn)擊次數(shù):87    更新時(shí)間:2025-07-03
  菌種凍干(Lyophilization,又稱冷凍干燥)是微生物保存領(lǐng)域的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù),通過低溫冷凍→真空升華→解析干燥三步法,將菌體中的水分以冰晶形式直接升華去除,獲得含水量低(通常<5%)的干燥菌粉。
 
  菌種凍干的核心在于通過物理狀態(tài)變化實(shí)現(xiàn)菌體脫水,同時(shí)保留其生物學(xué)活性。其工藝流程可分為三個(gè)階段:
 
  1.預(yù)處理階段:保護(hù)劑添加與菌體穩(wěn)定
 
  保護(hù)劑選擇:糖類(如海藻糖、蔗糖):通過氫鍵替代水分子與菌體蛋白質(zhì)結(jié)合,防止冷凍導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性;
 
  蛋白質(zhì)類(如牛血清白蛋白、脫脂奶粉):形成包裹層,減少冰晶對(duì)細(xì)胞膜的機(jī)械損傷;聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇):調(diào)節(jié)溶液粘度,控制冰晶生長速率。
 
  菌體懸浮:將菌體與保護(hù)劑按一定比例(通常1:1~1:5)混合,制成濃度約10~100 CFU/mL的懸浮液,確保凍干后菌粉的活菌數(shù)達(dá)標(biāo)。
 
  2.冷凍階段:冰晶形成與細(xì)胞保護(hù)
 
  快速冷凍(-80℃以下):通過液氮或超低溫冰箱實(shí)現(xiàn),使菌體周圍水分迅速形成細(xì)小冰晶(直徑<10 μm),減少冰晶對(duì)細(xì)胞膜的穿刺損傷;
 
  慢速冷凍(-20℃至-40℃):適用于部分對(duì)低溫敏感的菌種(如某些放線菌),通過控制降溫速率(0.5~1℃/min),允許細(xì)胞內(nèi)水分逐步外排,減少胞內(nèi)冰晶形成。
 
  3.升華干燥階段:真空環(huán)境下去除游離水
 
  真空系統(tǒng)啟動(dòng):當(dāng)樣品溫度降至-40℃以下時(shí),開啟真空泵(壓力通常<10 Pa),使冰晶直接從固態(tài)升華為氣態(tài)(無需經(jīng)過液態(tài));
 
  物理原理:根據(jù)克勞修斯-克拉佩龍方程,低溫下冰的飽和蒸氣壓遠(yuǎn)低于水,因此真空環(huán)境可加速冰晶升華。
 
  加熱控制:通過隔板加熱(溫度范圍-20℃~30℃)提供升華潛熱(約2838 kJ/kg),避免樣品溫度過低導(dǎo)致升華速率下降;
 
  4.解析干燥階段:去除結(jié)合水
 
  提高溫度(20℃~40℃):在升華干燥完成后,進(jìn)一步升高樣品溫度,破壞菌體與結(jié)合水之間的氫鍵,將殘留水分(通常1%~3%)降低;
 
  作用:結(jié)合水是微生物代謝活動(dòng)的主要介質(zhì),去除后可抑制酶活性與化學(xué)反應(yīng),顯著延長菌種保存期。
 
  終點(diǎn)判斷:通過壓力上升測試(Pressure Rise Test)或殘余水分分析(如卡爾費(fèi)休法)確認(rèn)干燥完成,通??偢稍飼r(shí)間需12~48小時(shí)。
菌種凍干

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